Pasien perlu diinformasikan mengenai prosedur pemeriksaan, termasuk tujuan pemeriksaan, pengambilan sampel, pemeriksaan sampel, dan persetujuan pemeriksaan atau informed consent. Pasien sifilis dianjurkan untuk tidak mengoleskan antiseptik ataupun salep antibiotik pada lesi sebelum pengambilan sampel.[1,11]

Peralatan

Alat dan bahan yang diperlukan dalam pemeriksaan mikroskop medan gelap yaitu:

• Mikroskop lapangan gelap, yaitu mikroskop optik khusus dengan kondensor medan gelap yang memproyeksikan cahaya pada sudut miring sehingga cahaya dibelokkan atau dihamburkan oleh spesimen. Hal ini menyebabkan spesimen tampak terang dengan latar belakang gelap yang kontras, sehingga meningkatkan visibilitas spesimen

• Glass slide dengan coverslip

• Blotting paper
• Alat swab steril
• Sarung tangan bedah steril
• Scalpel

• Spuit injeksi

• Botol minyak imersi dengan aplikatornya. Minyak imersi berfungsi mengoptimalkan pengumpulan cahaya yang tersebar oleh lensa objektif.
• Larutan sodium polyanethol sulphonate dalam cairan salin steril atau larutan sodium oksalat dalam buffer fosfat pada pH 8 untuk sampel leptospirosis

• Alat sentrifugasi untuk sampel leptospirosis

• Polyvalent Vibrio cholerae O1 antiserum untuk sampel kolera

• Larutan salin fisiologis steril atau phosphate-buffered saline, ph 7.0-0 untuk sampel kolera[1,7,8]

Posisi Pasien

Dalam pengambilan sampel, pasien dapat diposisikan duduk ataupun berbaring. Pengambilan sampel perlu tetap memperhatikan kewaspadaan keamanan.[1]

Prosedural

Mikroskop lapangan gelas harus sudah disiapkan sebelum pengambilan sampel agar sampel dapat langsung diperiksa karena motilitas mikroorganisme berkurang seiring waktu.[1,9]

Gunakan 2 lapis sarung tangan, dimana sarung tangan terluar nantinya dilepas setelah selesai pengambilan sampel dan sebelum pemeriksaan mikroskop medan gelap.[1]

Pemilihan Lokasi Sampel Pemeriksaan

Pengambilan sampel pemeriksaan berbeda-beda tergantung jenis penyakit dan kondisi klinis pasien.

Sifilis:

Untuk penyakit sifilis, sampel didapatkan dari swab lesi primer atau sekunder yang masih basah atau baru atau eksudat serosa tanpa eritrosit. Sensitivitas pemeriksaan berkurang pada lesi yang telah mengering atau menyembuh. Pada lesi yang telah mengering, sampel serum diambil dengan sedikit melukai atau melakukan irisan menggunakan scalpel pada tepi lesi dimana terdapat lebih banyak Treponema.

Irisan dilakukan sehati-hati mungkin agar tidak menyebabkan perdarahan. Tujuannya adalah mendapatkan eksudat serosa dan meminimalisir kontaminasi oleh darah ataupun pus dari infeksi sekunder. Sampel serum tidak boleh diencerkan meskipun kuantitasnya sedikit.

Pada sifilis primer, sampel diambil dari serum jernih pada lesi (chancre) primer. Aspirat dari pembesaran limfonodi dapat diambil jika lesi primer telah menyembuh atau tidak nampak akibat adanya fimosis. Pada sifilis sekunder, sampel dapat diambil dari lesi basah (mukosa atau kondilomata lata) atau serum yang diambil dengan membuat sedikit irisan pada lesi yang kering. Pada sifilis kongenital, sampel dapat diambil dari lesi basah atau lesi bulosa pada kulit di fase awal sifilis kongenital.[1,9]

Sampel harus segera diperiksa dalam 20 menit setelah pengambilan sampel dimana motilitas mikroorganisme masih dapat terlihat. Adanya darah atau pus pada sampel harus dibersihkan dengan hati-hati karena dapat mengganggu identifikasi mikroorganisme pada pemeriksaan mikroskop.[1,9]

Leptospirosis:

Untuk penyakit leptospirosis, sampel diambil dari darah pasien.[7,8]

Kolera:

Untuk penyakit kolera, sampel diambil dari feses cair yang seperti air cucian beras. Jika feses cair tidak seperti air cucian beras, maka sampel perlu diencerkan cairan salin terlebih dahulu dengan perbandingan 1:1.[7,8]

Penyakit Lyme:

Pemeriksaan mikroskop lapangan gelap bukanlah pemeriksaan diagnostik untuk penyakit Lyme, tetapi pemeriksaan mikroskop lapangan gelap dapat digunakan dalam bidang mikrobiologi untuk mempelajari B. burgdorferi yang telah dikultur atau dari kutu Ixodes yang menjadi vektor penyakit Lyme pada manusia.[3,6]

Prosedur Pengambilan Sampel pada Kasus Sifilis

Pada pasien sifilis, prosedur pengumpulan sampel dilakukan sebagai berikut:

1. Alat swab steril direndam cairan salin, kemudian permukaan lesi dibersihkan dan dilap kering
2. Lesi dicubit dengan jempol dan jari telunjuk tangan kiri pemeriksa untuk mengeluarkan serum jernih bebas eritrosit
3. Tangan kanan mengambil coverslip dan diaplikasikan atau ditempelkan langsung pada serum dari lesi untuk mengambil sampel serum tersebut
4. Letakkan coverslip pada glass slide dengan bagian yang telah dioles serum berada di bawahnya (di antara coverslip dan glass slide)
5. Tekan hati-hati dari atas coverslip, pastikan tidak ada gelembung udara
6. Lepaskan sarung tangan bagian terluar, kemudian lanjutkan dengan pemeriksaan mikroskop lapangan gelap[1,11]

Jika sampel berasal dari limfonodi, 0,1 ml cairan salin steril diinjeksikan terlebih dahulu ke limfonodi yang membesar dengan tangan kanan. Kemudian, tangan kiri melakukan pemijatan pada limfonodi, baru diaspirasi dan diteteskan pada glass slide dan dilanjutkan sesuai prosedur di atas.[1]

Prosedur Pengambilan Sampel pada Kasus Leptospirosis

Pada pasien leptospirosis, prosedur pengumpulan sampel dilakukan sebagai berikut:

1. Mengambil darah pasien (5 ml) kemudian dimasukkan dalam vial yang telah berisi larutan sodium polyanethol sulphonate dalam cairan salin steril atau larutan sodium oksalat dalam buffer fosfat pada pH 8
2. Sampel kemudian disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit untuk membentuk sedimen elemen selular
3. Plasma supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 10 µl dan diteteskan pada glass slide kemudian ditutup dengan coverslip dengan hati-hati agar tidak membentuk gelembung udara[8,12]

Prosedur Pengambilan Sampel pada Kasus Kolera

Pada pasien kolera, prosedur pengumpulan sampel dilakukan sebagai berikut:

1. Teteskan 1 tetes polyvalent V. cholerae O1 antiserum di salah satu ujung glass slide

2. Ambil sampel feses air cucian beras dan teteskan 1 tetes pada bagian ujung glass slide yang telah diteteskan antiserum tadi
3. Ambil kembali sampel feses air cucian beras dan teteskan 1 tetes di ujung lain glass slide (tanpa campuran antiserum)
4. Tutup kedua ujung glass slide masing-masing dengan coverslip[7,13]

Cara Pemeriksaan Mikroskop Lapangan Gelap

Setelah pengumpulan sampel, dilakukan pemeriksaan mikroskop lapangan gelap dengan prosedur sebagai berikut:

1. Lampu mikroskop dinyalakan sampai skala maksimal
2. Kondensor lapangan gelap dinaikan, kemudian minyak imersi diteteskan sebanyak 1 tetes di atas kondensor
3. Teteskan 1 tetes minyak di atas coverslip dan di bawah glass slide

4. Letakkan glass slide sedemikian sehingga minyak imersi berpadu tanpa ada gelembung udara
5. Atur perbesaran lensa, mulai pada perbesaran 10 kali hingga lapang pandang terlihat semua merata dengan kontras maksimal
6. Lakukan pemeriksaan dengan peningkatan perbesaran lensa secara bertahap menjadi 40 kali dan 100 kali, kemudian objek imersi minyak diubah menjadi mode medan gelap untuk mengurangi ukuran apertura
7. Objek imersi minyak atau objek medan gelap diturunkan hingga bersentuhan dengan minyak
8. Sampel akan terlihat seperti objek putih pada latar gelap. Lakukan identifikasi mikroorganisme berdasarkan morfologi dan motilitasnya
9. Setelah selesai, buang semua alat dan bahan pada wadah yang tepat[1]

Catatan Khusus:

Untuk sampel kolera, visualisasi terlebih dahulu sampel tanpa campuran antiserum. V. cholerae akan nampak motil seperti “shooting star” pada perbesaran 40 kali. Selanjutnya, lakukan visualisasi sampel dengan campuran antiserum.

Jika tidak ada motilitas, maka mikroorganisme tersebut adalah V. cholerae (hasil positif), namun jika pada kedua sampel (sampel dengan antiserum dan tanpa antiserum) tidak ditemukan motilitas mikroorganisme atau tidak ada perbedaan motilitas, maka mikroorganisme tersebut bukanlah V. cholerae (hasil negatif).[2,7,13]

Follow up

Hasil yang akurat bergantung pada kecepatan pemeriksaan (dalam 20 menit, untuk meminimalisir hilangnya motilitas yang dapat terlihat), dan keahlian laboran serta ekspertise dalam mengidentifikasi mikroorganisme.[1,9]

Hasil dikatakan positif jika ditemukan mikroorganisme kausal penyakit, yaitu Treponema sp. pada sifilis, frambusia, dan pinta; Leptospira interrogans pada leptospirosis; dan V. cholerae pada kolera.[1,2,4,5,7,8]

Gambaran Treponema

T. pallidum akan nampak berbentuk spiral tipis, putih, dan berkilau, berukuran panjang 6-15 µm dan lebar 0,25 µm, dengan karakteristik gerakan berpilin disertai perubahan bentuk seperti angulasi, berkelok, undulasi, melingkar, melilit, dan ekspansi.[1,2,4,5,7,8]

Gambaran Leptospira

L. interrogans akan nampak berbentuk spiral dengan ukuran 6-20 μm x 0,1 μm, dengan gerakan rotasi sepanjang poros tubuh dan bergerak maju mundur searah dengan poros tubuhnya.[1,2,4,5,7,8]

Gambaran Vibrio cholera

V. cholerae akan nampak berbentuk batang berlekuk, berukuran panjang 1-3 µm dan diameter 0,5-0,8 µm, dengan flagel tunggal yang membuatnya motil. Hasil dikatakan negatif jika tidak ditemukan mikroorganisme kausal penyakit.[1,2,4,5,7,8]

Perhatian Khusus

Perlu diperhatikan bahwa hasil negatif palsu dapat muncul jika mikroorganisme pada sampel terlalu sedikit untuk dapat teridentifikasi, pasien telah mendapat terapi, aplikasi antibiotik topikal pada lesi, atau lesi telah menyembuh.[1,5,11]

Pada sifilis, jika tidak nampak Treponema pada pemeriksaan mikroskop lapangan gelap namun kecurigaan klinis tinggi, pemeriksaan dapat diulang selama 3 hari berturut-turut.[1,11]